大豆根腐病生防菌筛选及其防效评价

2023年中央一号文件指出我国将深入推进大豆和油料产能提升工程，因此对大豆产量的实际需求导致我国大豆连作现象不断加重。黑龙江省作为我国大豆主产区，其大豆生产对保障我国大豆产业安全具有重要意义。大豆根腐病作为大豆栽培生产上的主要病害之一，近年来在我省的危害逐年加重，严重制约我国大豆生产能力的提高。为了切合国家开发作物病虫害绿色防控新技术，发展绿色农业的指导思想，寻找一种新型、高效且环境友好型的大豆胞囊线虫防治策略，是实现我国“扩豆稳粮”和现代农业可持续发展的关键。

我们前期的研究结果发现多种生防菌对大豆根腐病病原菌均存在一定的抑制作用，但是这些生防菌对大豆根腐病是否真的存在生防效果，其田间防效又如何？还有待进一步研究。本项目以实验室保存的47株生防菌为研究对象，探讨其对黑龙江省常见的3种（尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌和茄腐镰孢菌）大豆根腐病病原菌的防治效果，采用单一菌株和复合菌株联合防效筛选的方法，以期筛选出对大豆根腐病具有高效防治效果的生防菌。本研究为大豆根腐病生防菌剂研发提供优质菌源，同时也为大豆生产绿色防控技术发展提供帮助

（1）大豆根腐病生防菌实验室筛选

试验采用实验室原有保存的47株拮抗微生物为研究对象，采用平板对峙法和生长速率法对大豆根腐病的三种病原菌进行抑菌效果筛选，结合生防菌体外抑菌活性测定，进一步评价47株拮抗菌对大豆根腐病不同病原菌的抑菌效果，分别筛选出对三种病原菌具有良好抑制效果的拮抗菌。

（2）大豆根腐病盆栽防效评价

首先，将上述筛选得到的拮抗菌进行大豆促生作用研究，明确拮抗菌对大豆生长的影响。结合生防菌盆栽防效测定，综合评价单一菌株和复合菌株对大豆根腐病不同病原菌的防治效果。从不同角度构建大豆根腐病拮抗菌类型。

（3）大豆根腐病田间防效评价

针对上述评价分析结果得到的拮抗菌类型，采用田间小区试验，进一步验证筛选得到的拮抗微生物类型对大豆根腐病的防治效果。最终提出一套大豆生产高效可持续的抗大豆根腐病技术。

（1）大豆根腐病的危害及发生现状

大豆根腐病是大豆生产中一种危害严重的土传病害，由于其传播广泛，多种病原物复合侵染的繁杂性和难以控制的特点，大豆根腐病已经成为大豆生产上的主要病害之一^[1]。该病害1991年在我国东北地区首次发现后，主要以东北大豆产区发生最为严重，发病率高达75%~90%，减产率达到10%~30%，严重时可达到60%以上，甚至颗粒无收^[2-3]。病原菌主要入侵大豆的根部，从幼苗期到成熟期均能引起大豆根部腐烂，危害严重时可使整个植株萎蔫，甚至死亡，给农业生产造成巨大的经济损失。

大豆根腐病由多种病原体引起，不同地区的病原体类型也存在差异。现报道的主要病原菌有镰孢菌（Fusarium spp.）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）和腐霉菌（Pythium spp.）^[4-6]。截至目前，国内外已报道了可引起大豆根腐病的镰孢菌至少有32种，包含尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、茄腐镰孢菌（Fusarium solani）、三线镰孢菌（Fusarium tricinctum）、木贼镰孢菌（Fusarium equiseti）、厚垣镰孢菌（Fusarium chlamydosporum）、禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）、半裸镰孢菌（Fusarium semitectum）和燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）等^[6-8]，其中禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌和茄病镰孢菌为我国的优势菌，而尖孢镰孢菌（F. oxysporum）和茄腐镰孢菌（F. solani）为黑龙江省的优势菌，危害多种经济粮食作物，发生严重的经济损失^[6、8]。

（2）大豆根腐病的主要防治措施

大豆根腐病通常是由各种致病菌相互侵染发病，在土壤和宿主中长期存在，随土壤、水源和病株残体中传播，是及其难于防治的土传病害。每年由于该病害的发生能够造成高达数亿元的经济损失。此外，如与大豆胞囊线虫病形成复合侵染，损害将更加严重。

抗病品种的培育与推广是目前防治大豆根腐病最为普遍有效的方法之一。具有抗病性的品种不仅可以减少根腐病的发病情况，还可以保产增产。目前，我国已筛选鉴定出的高耐病品种有：绥农8号、绥农10号、垦农4号、鲁豆6号、九三绿豆、合交8号、汾豆33号、淮87号、豆交5986-4069和86-31004等，都是对大豆根腐病具有良好抗性的种质资源^[1、5]。

农业措施改变发病地块致病菌生长环境可有效防治大豆根腐病。如通过深翻秋起垄、中耕培土和轮作等改变大豆根腐病病原菌生存环境达到防治目的，其中轮作常被称为有效的农业防治方法之一。通过改变茬口减少田间根腐病病原菌积累，降低发病率。有研究认为通过玉米-大豆-玉米种植模式轮作3年以上可有效降低大豆根腐病发病率^[9]。

种子被药剂进行包衣处理是目前防治根腐病的最为有效的化学防治措施。在生产实践过程中为减少大豆幼苗根腐病的为害，通常会选取饱满无伤口的种子，在大豆播种前，用甲霜灵等药剂拌种，或对大豆种子进行包衣，通过种子处理的方法来减少大豆根腐病的发生。化学防治方法的应用，对于化学药剂的毒性及剂量控制至关重要。通过研制低剂量低毒性高防效的化学药剂，降低喷洒剂量及频率，能够有效避免化学药剂使用给农业生产带来的风险。

生物防治方法具有环境友好、药效期长、不易产生耐药性、无农药残留等多项优点，成为了防治病虫害最有效的手段，也是解决大豆根腐病的有效方法之一，具有广泛的应用前景，并在防治大豆尖孢镰孢菌根腐病这一方向潜力巨大。

综上所述，合理运用农业防治、生物防治和化学防治等综合多样的防治措施是防治大豆根腐病，确保大豆产业稳定发展的重要手段。

（3）大豆根腐病生物防治及应用

基于2020年我国农业要落实“一控两减三基本”的措施，生物防治以其绿色防治，无环境污染的优势，成为研究热点。目前大约有2000多个菌种被报道对根腐病具有良好的抑制作用，其中生防真菌占大多数。酵母菌（Yeast）、木霉菌（Trichoderma spp.）、绿僵菌属（Materialism spp.）、白僵菌属（Beauveria spp.）、毛壳菌（Chaetomiaceae spp.）、淡紫拟青霉菌（Peacilomyces Lilacinus）等研究报道最多^{[4、10、16]}，并取得显著成效。其中木霉菌利用的是抗生作用，可以针对尖孢镰孢菌对寄主的入侵行为进行阻碍，在田间大豆根腐病的防治中是应用最广的生防菌之一^[10、15]。既能有效的防治大豆根腐病，又可以促进大豆株系的茁壮生长。

生防细菌由于其广泛存在于土壤和植物根系中，有着促进植株生长，增加植物抗性、人工培养方式简便，并且繁殖速度快、种类繁多等优点，在大豆根腐病防治中被广泛研究及应用，最具代表性的有芽孢杆菌和假单胞菌，其中假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）对防治尖孢镰孢菌（F.oxysporum）有明显效果^[11-14]。杨可欣等针对已筛选出拮抗大豆根腐病尖孢镰刀菌的枯草芽孢杆菌，通过测定土壤酶类活性及根际土壤菌类数量发现其抑病率可达30%以上^[12]。有研究者通过对大豆根腐病生防细菌进行分类鉴定、发酵条件优化及室内抑菌效果检测等研究发现其对尖孢镰刀菌的拮抗作用可达60%^[13]。

目前，针对大豆根腐病生防菌已经开展了大量的研究，但是由于田间应用环境的限制，根腐病病原菌多样性等特点，导致生防菌防治效果的稳定性还存在一定局限性。因此，为了进一步筛选对大豆根腐病稳定高效的拮抗微生物，本项目通过对实验室保存的47株生防菌，进行大豆根腐病不同病原菌防效评估。采用实验室防效测定结合田间防效评估的方法，综合评价生防微生物单一菌株和复合菌株对大豆根腐病的综合生防效果。研究结果为绿色高效、可持续地控制大豆根腐病以及生防菌田间应用具有一定的实际意义。

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（1）从大豆根腐病多病原菌拮抗角度出发综合评价生防菌防治效果

大豆根腐病由于其病原菌种类繁多而成为其难于防治重要原因之一，本项目针对3种黑龙江省大豆根腐病常见病原菌进行生防菌防效评估，综合评价生防菌防治效果，能够更好的促进大豆根腐病生物防治应用研究，有助于制定系统的大豆根腐病绿色防控理论和技术体系。

（2）利用实验室多年筛选的生防菌为研究对象，开展大豆根腐病防效研究

本项目以实验室多年筛选出的47株生防菌为研究对象，针对大豆根腐病进行防效筛选，最终获得的生防菌株，会具有更强的拮抗作用，研究结果结合单菌株和多菌株复合拮抗筛选，有利于大豆根部土传病害的综合生防资源开发与利用。

技术路线

（1） 大豆根腐病生防菌实验室筛选

① 生防菌初筛

采用平板对峙法检验抑菌率进行初筛，以三种大豆根腐病致病菌（尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌和茄腐镰孢菌）为靶菌。首先将靶标菌接种至距平板一侧3cm处，再将活力较强的备检拮抗菌接种至另一侧相同的距离位置，对照组则单独接种病原菌，置25℃恒温培养箱中培养。测量并记录好病原真菌的菌落直径，调查抑菌效果。

② 生防菌复筛

用生长速率法对分离纯化后的菌株进行拮抗性复筛。生长速率法：首先将制备菌悬液与PDA培养基按1:9的比例混合，分别将靶标菌接种到混合培养基上，每个处理3次重复。对照组则为PDA培养基，在中心接种致病菌，调查抑菌率。

抑制率=[(对照菌直径-处理菌直径)/(对照菌直径-菌饼直径)]×100%

③ 生防菌体外抑菌活性测定

生防菌悬液制备：将生防菌置于LB液体培养基中培养2d，以8000 r/min下离心10min，弃去上清液，利用PBS缓冲液制备生防菌悬浮液，浓度为10⁸ cfu/mL备用。

病原菌孢子悬浮液制备：将镰孢菌在PDA培养基上培养5d，用PBS缓冲液提取孢子，将收集到的孢子悬液浓度调整为100个/mL备用。

挑选籽粒饱满、大小一致的大豆种子放置于培养皿中，0.5%的NaClO下进行消毒处理 2min，用无菌蒸馏水漂洗，将消毒后的种子置于含有湿度适中蛭石中培养，挑取长度相似且无病症的豆苗用于后续试验。

对上述大豆幼苗置于含有三层湿润灭菌滤纸的无菌培养皿中。用无菌接种针在大豆幼苗下胚轴处造成伤口，根据初筛和复筛的结果试验分为4组处理：滴加10μL病原菌分生孢子悬浮液于处理过的大豆幼苗；加入10μL PBS缓冲液于处理过的大豆幼苗；滴加10μL单种生防菌悬液和孢子悬浮液于处理过的大豆幼苗；滴加10μL混合生防菌悬液和孢子悬浮液于处理过的大豆幼苗。将经过处理后的大豆幼苗放置于培养皿中，同一处理接种5株小苗，重复3次。25℃常光下放置，5d后观察结果，记录发病情况，并计算发病率和病情指数。分级标准参考大豆根腐病病级分级标准按辛惠普等（1987）提出的0-5级的６级分类法进行调查。

发病率＝（发病株数/总株数） ×100%

病情指数＝∑（各级病株数×相对级数值）/（调查总株数×最高病级）×100%

④ 生防菌鉴定

针对不同病原菌筛选出的生防菌菌株进行鉴定。采用形态学观察，菌株的生理生化试验和分子生物学鉴定的方法进行鉴定。

（2） 盆栽防效

① 生防菌对大豆生长的影响

选取健康、大小一致的大豆种子，进行消毒处理，保湿催芽。生防菌菌落置于150mL LB液体培养基150r/min振荡培养24h；随后5000r/min离心10min，弃上清，收集菌体；最后，用50~120 mLPBS缓冲液冲洗菌体，获得OD₆₀₀值为0.3、0.5、0.8和1.0的生防菌菌悬液，待用。

设置OD₆₀₀值为0.3、0.5、0.8和1.0共4个处理，以PBS缓冲液浸种为对照（CK），分别以不同OD₆₀₀的菌悬液连续3d浇灌在灭菌蛭石中催芽的大豆种子，每个处理30粒种子，每天各处理浇灌菌悬液30mL。各处理于28℃培养3d，观察大豆出芽及健康情况，参照下列公式计算各处理发芽率。

发芽率/% = (种子总数量 - 未发芽种子数量)/种子总数量 × 100

取上述各处理出芽状况一致的种子，移栽入装有营养土的花盆中，每盆2株，每处理20株，随机浇灌各处理对应浓度菌悬液，每株10mL。盆栽苗置于28℃、16h光/8h暗的条件下培养14 d后，测量各处理大豆幼苗生长指标（株高、茎粗、叶面积、地上干重、地下干重）。

② 生防菌防效测定

取灭菌后高粱粒培养基，将病原菌取6个菌饼接种到灭菌高粱粒培养基中，于28℃暗培养7~10d。将带菌高粱粒转置25℃烘箱中烘干12h，后制成粉末扩繁体。取1g粉末扩繁体接入9mL无菌水，于28℃、150r/min条件下振荡30min，逐级梯度稀释至10^-4。计算不同梯度扩繁体的孢子量，以每g扩繁体中包含的孢子数量约为3×10⁵用于后续接种。

以上述最适生防菌悬液浓度处理大豆，将带菌高粱扩繁体与土壤以15∶100质量比混合，制成病原菌接种土壤。试验设置3个处理：①正常催芽大豆播种于镰孢菌接菌的土壤中；②单一和混合生防菌预处理后的催芽大豆移栽入镰孢菌接菌土壤中；③正常催芽大豆播种于病原菌接菌的土壤中，生长1d后，每株幼苗补充10mL生防菌单一和混合菌悬液。

所有植株置于人工气候培养箱，于28℃、16h光/8h暗的条件培养。每个处理10盆，每盆2株，实验重复3次。接种2周后，测定不同处理大豆生长指标（株高、茎粗、叶面积、地上/地下干重等），调查大豆根腐病发病情况，并计算病情指数、死亡率和防治效果。

死亡率= 死亡株数/调查总株数 × 100%

防治效果= (对照病情指数-处理病情指数)对照病情指数 × 100%

（3） 田间防效

试验采用随机区组设计，采用6行区，5m行长，0.5cm垄距，小区面积15m²，每个处理3次重复，试验周边设置保护行，试验播种量35万株/hm²。在垄底均匀铺撒一层包裹着病原菌菌丝的高粱粒（约80g/垄），覆盖上0.5cm厚的土，再播入已浸种的大豆种子，株距10cm，行间距0.5cm，播种深度3-5cm， 每小区做为一个处理，3垄约100株苗，随机区组排列，每处理3重复。生防菌处理组浇稀释好的生防菌菌悬液（每一个5米小垄约1000mL），对照组浇等量的水，每5天一次。在大豆出苗后的第45天测量植株的叶绿素含量、株高、根长、鲜重及干重。调查病情级数，统计病情指数，每个处理调查30株。

在大豆出苗后30d，采用5点取样，每点取1.53m长（即1m²）的大豆株数，计算大豆的出苗率。分别在出苗后30和60d，各处理小区选取代表性的5点，每点5株，计算病情指数调查根腐病情况并计算病情指数，计算防效。

产量及产量构成因子的调查：在大豆完熟期（R8期），进行测产并计算单位面积产量。同时从收取的植株中随机抽取10株，调查大豆的株高、单株粒数、单株荚数、百粒重等产量构成因子。

拟解决问题q

在实际田间环境条件下，生防微生物是否能够实现对大豆根腐病的拮抗作用呢？筛选得到的生防微生物是否能够应对田间多样的根腐病病原菌呢？

本项目以实验室原有保存的47株拮抗菌为主要研究对象，针对黑龙江省常见三种大豆根腐病病原菌，首先采用实验室和田间双向条件筛选，再通过单一菌株和复合菌株综合评价拮抗菌对大豆根腐病的防治效果，最终得到能够高效控制田间大豆根腐病发生的拮抗菌类型。、

预计成果

（1）筛选出一套具有良好生防效果的大豆根腐病生防菌体系；

（2）撰写研究报告；

（3）发表学术论文1篇

（4）支持5名本科学生完成毕业论文

2024年8-12月

（1） 查阅资料，准备试验材料；

（2） 生防菌实验室筛选；

（3） 生防菌株鉴定

2025年1-6月

（1） 分析数据；

（2） 生防菌促生作用研究；

（3） 生防菌盆栽防效评价。

2025年7-12月

（1） 分析数据；

（2） 生防菌发酵液制备；

（3） 生防菌田间防效评价。

2026年1-8月

（1） 全面完成研究内容，整理数据，发表文章；

 （2）形成研究报告，进行结题。