大庆市牛虻的分类学鉴定及病原携带情况调查

申报人:娜木汗 申报日期:2024-06-25

基本情况

2024
大庆市牛虻的分类学鉴定及病原携带情况调查 盲选
创新训练项目
农学
动物医学类
学生自主选题
二年期
虻虫是一类能吸血的昆虫,其中牛虻最为常见。在黑龙江省牛虻分布广, 种类较,它通过机械性吸血传播疾病,危害人畜。本项目旨在用形态学 与分子生物学相结合的方法,对采集得到的牛虻进行分类鉴定,并扩增六种 牛虻的线粒体基因组序列,以此推进虻科的基因组数据库的建立。此方法有 效的解决了形态学文献中图片数据不足和 Gebank 中缺乏虻类序列信息的问 题,同时结合的分子技术可以弥补了形态学的限制性。

指导教师一直从事人兽共患寄生虫方面的研究,在实验设计方面提供了大
量建议,也为本项目实验的进行提供了实验室并配备专业仪器;在团队中
注重对成员创新意识、合作能力的培养,在撰写项目申请书中提出专业性
的建议。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
娜木汗 动物科技学院 动物医学 2023 虻的分子生物学鉴定
刘天贺 动物科技学院 动物医学(创新人才班) 2023 虻所携带的病原流行病学检测
时千惠 动物科技学院 动物医学 2023 虻的形态学鉴定
冯帅 动物科技学院 动物医学(创新人才班) 2023 样品采集
付辰涛 动物科技学院 动物医学(创新人才班) 2023 相关因素统计学分析

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
邱鸿宇 动物科技学院

立项依据

 虻类是重要医学和兽医学昆虫,不仅能够通过叮咬、吸血等方式骚扰人畜,还能作为人畜
之间的传播媒介传播多种疾病,它以医学昆虫最典型的机械性吸血传播为显著特征。由于虻个
体较大、口器粗大,在被它叮咬的时候,会非常疼痛,在虻类吸血被打断后,会重新寻找宿
主,所以中断的次数越多越增加了机械传播的机会。虻还可以生物性地传播疾病。虻类在我国
主要传播锥虫、野兔热、马传染性贫血和炭疽等。虽然中国虻科区系研究已经取得了重要进
展,物种数量已经达到了世界上已知物种总数的百分之十,但仍远未全面覆盖中国虻科区系。
目前,虻相关的分类研究资料和数据还相对较少,虻科线粒体全基因组序列不足十个。寄生虫
的有效鉴定对当前寄生虫的防控至关重要,同时,不同吸血节肢动物所携带病原具有一定宿主
特异性。分子生物学发展至今,寄生虫的鉴定已经将传统形态学与分子生物学慢慢结合,极大
的增加了鉴定的准确率。而对虻的鉴定以及物种描述相关研究报道较少,多通过文字对其进行
简单的形态描述,少有关于形态学图片的相关数据。同时,线粒体基因序列在寄生虫鉴定中多
有应用,已经称为标准的分子 maker,可以减少形态学方法单一使用的局限性。因此,本研究
拟采用形态学与分子生物学方法,对牛虻进行种属分类鉴定。并扩增牛虻的线粒体基因序列,
填补虻科基因组数据库,为探究虻科分类以及深入研究奠定基础。同时检测虻所携带病原情
况,并对其感染因素进行分析,为虻传疾病防控奠定基础。
(1) 样品的采集
(2) 虻的形态学鉴定
(3) 虻的分子生物学鉴定
(4) 虻所携带病原的流行病学检测
(5) 相关因素统计学分析
 虻,俗称马蝇,瞎虻,属于虻科,是双翅目的吸血节肢动物(BFA),包括 4 个亚科 144
属。它们通过机械和生物手段传播疾病,影响野生动物、家畜和人类的重要病原传播媒介。虻
科成员可传播 80 多种病毒、细菌和原生动,对牲畜和野生动物构成重大风险,因此具有显著
的兽医学和公共卫生意义。虻科成员具有丰富的物种多样性,包括 4500 多个种和亚种,广泛分布在世界各地。在亚热带和热带地区尤其丰富。它们主要在夏季白天在动物周围活动。雌性
虻需要血餐来维持产卵所需营养。叮咬家畜后,含有各种抗凝血剂和过敏原的唾液被注射到宿
主体内,导致过敏反应和疼痛。
早期的虻科分类主要依据其后足胫节末端是否存在刺距结构,进而划分为距虻亚科
Pangoninae)与虻亚科(Tabaninae)。后又经 Mackerras 对外生殖器进行了系统研究并形成
了目前所使用的三个亚科分类体系。中国有 3 个亚科 14 个属,458 种,东北三省有 2 个亚
科,6 个属,88 [1]。虻属(Tabanus)的首次建立于瑞典学者 Linnaeus 在十八世纪五十年代
末,随后学者们便展开了对虻科的系统分类的研究。形态学鉴定主要基于头部结构,特别是愈
伤组织、触角、眼睛、翅膀和胡须的特征,以及身体、腿和翅膀的颜色和图案。具体特征包
括:是否存在后足胫节末端刺距;外生殖器特征之间的的差异等特征。现如今,从事虻相关形
态学鉴定的科研工作者多采用 3 亚科分类法对虻进行分类研究,分别为距虻亚科,虻亚科和斑
虻亚科。其中,距虻亚科包含 3 个族,包括距虻族,长喙虻族和枝虻族 [4]
除了经典的形态学鉴定之外,序列分析可提供高度重复且信息丰富的数据,且对于不同的
阶元或物种可选择合适的分子标记进行分类群的系统学研究。目前在双翅目系统发育研究中常
用的分子标记一个为核糖体 DNAr DNA28S D3 序列;另一个是线粒体细胞色素 C
化酶亚基 ICytochrome C oxidase subunit ICOX1)基因前半部分的一段包含 650bp 的这一
特定区段。因此,有必要以核糖体 28S D3 序列和线粒体 COX1 为分子 marker 对虻进行物种
鉴定。应用分子方法进行调查的过程中会获得大量的可靠序列,这些序列可以丰富现有的分子
数据库,为进一步鉴定提供可靠基础序列数据 。这些数据可以用来研究分子遗传、进化的规
律和种群分布特点。而进行相关研究采用的方法主要有三种,分别是最大可能性法(ML)、
贝叶斯法(Bayesian)和最大似然法(MP)。因此有必要在获得可靠数据的基础上应用上述方
法进行遗传进化分析。
斑虻亚科与虻亚科、距虻亚科具有很多类似的特点 [5]。以往,来自世界各地的专家学者对
虻科的分类进行过广泛的调查研究[6],特别是 Ricardo, G.A.[7]Stekhevn, S.[8]Philip, C.B.
[9],其他外国学者先后在尼泊尔[10],韩国[11],朝鲜[12],日本[13],印度[14],和东亚地区[15]以及
北美和欧洲等地对虻科种类作过调查,并增添了不少新虻种。截至到现在全世界已经有 144
4 455 种虻科昆虫被记录在册。到目前为止,目前已知的牛虻有 458 种,其中有 258 种在
中国分布,约为 56%。部分新种已报道于华南及西南地区,并可能在南边的邻国也有分布。又
或许虻科为一个较为演化的类群,中国特有种应该更多一些。虽然中国虻科区系研究已经取得
了重要进展,物种数量已经达到了世界上已知物种总数的百分之十,但仍远未全面覆盖中国虻
科区系。 虻类对动物的叮咬不仅会造成剧烈的疼痛或皮炎,引起继发感染,还骚扰动物使动物
不停移动、动荡不安,为了躲避牛虻的叮咬也会造成牲畜能量和精力的巨大损耗,使其不能得
到充分的休息和采食。虻类还能传播许多疾病[16],如炭疽、野兔热、马传染性贫血等[17]。如牛
虻未吸饱血液前被宿主或饲养者驱赶走,随后又不断向其他宿主吸血,从而机械性地传播细菌
或病毒而引起疾病[18]。每个虻都吸入了大量的血液,这使得血液中浓度较低的微生物可以在牛
虻体内进行繁殖,提高了虻类传播细菌或病毒的有效性[19]。某些哺乳动物锥虫还能经虻类机械
性地或生物性地传播,亚洲文献曾报导马、大象及其他哺乳动物的某种苏拉病也能经虻类传
播。相关文献报导寄生于糜鹿和绵羊的施氏血管线虫,也需要在虻类的体内进行发育[20]
(四)创新点与项目特色
虻的有效精准确鉴定,对当前的寄生虫防控与科学研究的基础,主要依赖于相关从业人员
通过传统的形态学方法对其进行鉴定。分子生物学鉴定在绝大多数寄生虫鉴定中具有较大的优
势,但目前有关虻类的基因组数据相关研究相对较少。因此,本研究拟综合应用形态学和分子
生物学鉴定两种方法对采集到的虻进行鉴定,为虻的深入研究奠定基础。同时,不同种吸血节
肢动物所携带病原具有宿主特异性,对所采集样本进行病原检测有助于我们对虻所传播病原进
一步了解,并为虻传病原防控奠定基础。
参考文献:

[1]许荣满. 黑龙江省虻类采集[C/ /医学昆虫调查集刊. 北京:中国人民解放军战士出版 社,1983: 101 105

[2]Moucha J. Horse-flies (Diptera:Tabanidae) of the world synoptic catalogue[J]. Acta Ent. Mus. Nat. Pragae, Suppl.

[3]Baldacchino F, Desquesnes M, Mihok S, et al. Tabanids: neglected subjects of research, but important vectors of disease agents[J]! Infect. Genet. Evol, 2014; 28: 596-615.

[4]陆宝麟, 吴厚永. 中国重要医学昆虫分类与鉴别[M]. 郑州:河南科学技术出版社, 2003

[5] Gonzalez C R. Dasybasis elquiensis, a new species of horse fly from Northern Chile (Diptera: Tabanidae: Diachlorini)[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2000, 95(5): 629-632.

[6]Morita S I, Bayless K M, Yeates D K. et al. Molecular phylogeny of  the horse flies: a framework for renewing tabanid taxonomy[J]. Systematic Entomology, 2016, 41: 56-72.

[7] Coher E I. Species related to Tabanus basalis Macquart, with the description of a new species from Nepal[J]. Bull. Brooklyn Ent. Soc, 1962, 107:157-162.

[8]Coher E I. Asian biting fly studies Ⅱ. Tabanidae.species related to Tabanus birmanicus(Bigot), 1892, with the description of a new species from Nepal[J]. Pacif. Ins, 1971a, 13(2): 321-323.

[9] Chainey J. Horse-flies, deer-flies and clegs (Tabanidae). In: Kirk-Sproggs AH, Sinclair BJ (Eds) Manual of Afrotropical Diptera, Nematocerous Diptera and lower Brachycera[J]. South African National Biodiversity Institute, Pretoria, 2017 893–913

[10] Coher E I. Asian biting fly studies Ⅲ. Tabanidae species related to Tabanus caerulescens Macquart, 1838, with the description of a new species from Nepal[J]. Pacif.Ins, 1971b, 13(2): 325- 328.

[11] Ouchi Y. On some horseflies belonging to the subfamily Pangoniinae from Eastrn and Northern Corea[J]. Shanghai Sci, Inst. Sect. Ⅲ. 1939, 4: 175-189.

[12] Murdoch W P, Takahasi. The female Tabanidae of Japan, Korea and Manchuris[J]. Mem. Ent. Soc. Wash, 1969, 6: 230.

[13] Watanabe M. Studies on bionomics of deer fly, Chrysops suavis Loew (Tabanidae,Diptera)[J]. Jpn. Sanit. Zool, 1968, 19(2): 87-92.

[14] Stekhevn S. Tabanids from Sumatra and Borneo[J]. Tijdschr, Ent, 1932b, 75: 78-8

[15] Philip C B. Further notes on Far Eastern TabanidaeⅦ new Generalized Oriental species of Unusual Zoogeographic interest[J]. Pan-Pacif. Entomologist, 1980, 56(1): 77-78.

[16] Bogitsh B J, Carter C E, Oeltmann T N. Chapter 18-Arthropods as Vectors. In B. J. Bogitsh, C. E. Carter, & T. N. Oeltmann (Eds.)[M]. Human Parasitology (Fifth Edition): Academic Press, 2019;

[17] David T J, William A P. Med Vet Entomol. Saunders Elsevier, St. Louis, Missouri. 2006.

[18] 何静, 刘增加, 徐宏江.青海省双翅目虻科昆虫研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2016, 27(06): 573- 576.

[19] 刘增加, 石淑珍, 宫占威. 甘肃虻科小志[C]. 甘肃省动物学会学术讨论论文. 2001: 1-7.

[20] 高远. 马五种盅口亚科线虫线粒体全基因组比较与进化分析[D]. 黑龙江八一农垦大学, 2018.

 

 虻的有效精准确鉴定,对当前的寄生虫防控与科学研究的基础,主要依赖于相关从业人员
通过传统的形态学方法对其进行鉴定。分子生物学鉴定在绝大多数寄生虫鉴定中具有较大的优
势,但目前有关虻类的基因组数据相关研究相对较少。因此,本研究拟综合应用形态学和分子
生物学鉴定两种方法对采集到的虻进行鉴定,为虻的深入研究奠定基础。同时,不同种吸血节
肢动物所携带病原具有宿主特异性,对所采集样本进行病原检测有助于我们对虻所传播病原进
一步了解,并为虻传病原防控奠定基础。

 

12024.06 - 2024.07,查阅相关文献,引物的设计与合成,样品采集;
22024.08- 2024.12,样品采集,形态学鉴定,核酸的提取、PCR扩增、序列分析;
32025.01- 2025.02,遗传进化分析;
42025.03 - 2025.06,形成报告并撰写论文。 

课题组前期已经对大庆市内的主要牛虻进行了形态学鉴定( 1、图 2)和分子鉴定,应用 引物扩增线粒体 COXIPCR 结果显示 COXI 1500bp( 3),两种牛虻线粒体基因组的扩增 结果( 4、图 5),进一步进行测序及进化分析表明这两种虻分别为范式斑虻(Chrysops vanderwulpi)和土耳其麻虻(Haematopota turkestanica)。

1 范式斑虻形态图

A:范式斑虻背侧面;B:范式斑虻腹面;C:范式斑虻头部;

D:范式斑虻头部侧面;E:范式斑虻的翅

Fig. 1 Morphological map of Chrysops vanderwulpi

A: The dorsal side of Chrysops vanderwulpi; B: The ventral surface of Chrysops vanderwulpi; C: The head shot ofChrysops vanderwulpi;

D: The lateral side of Chrysops dissectus's head; E: The wing of Chrysops vanderwulpi

2 土耳其麻虻形态图

A:土耳其麻虻背侧面;B:土耳其麻虻腹面;C:土耳其麻虻头部;

D:土耳其麻虻头部侧面;E:土耳其麻虻的翅

Fig. 2 Morphological map of Haematopota turkestanica

A: The dorsal side of Haematopota turkestanica; B: The ventral surface of Haematopota turkestanica; C: The

head shot of Haematopota turkestanica;

D: The lateral side of Haematopota turkestanica's head; E: The wing of Haematopota turkestanica

M: 2 000 DNA marker; 1: Chrysops vanderwulpi;2: Haematopota turkestanica;

3 牛虻 cox 1 扩增结果图

Fig. 3 The cox 1 amplification results of gadflies

M5 000 Marker CV-1:目的基因

4 范式斑虻 CV-1 基因序列 PCR 结果

Fig.4 The PCR results of the CV-1 gene sequence of

C.vanderwulpi

M5 000 Marker HT-1:目的基因

5 土耳其麻虻 HT-1 基因序列 PCR 结果

Fig.5 The PCR results of the HT-1 gene sequence of

H.turkestanica

大创项目所依托课题组自 2011 年一直从事媒介节肢动物以及其传播病原的相关研究,已 发表相关的学术论文 50 余篇,其中一区论文 3 篇、二区论文 6 篇。获黑龙江省自然科学三等奖 1 项,授权发明专利 3 项,出版专著 2 部近年来,获批国家自然科学基金项目 2 项。在前期课题的资助下,项目主持人参与研究课题所撰写文章《Microbiota profile in organs of the Horsefly (Diptera: Tabanidae)in Northeastern China》投稿在 Science of the Total Environment。申请人请人已掌握虻种鉴定、肠 道菌群分离、生物信息学分析等技术,为本项目的顺利实施提供了坚实的技术保障。 

经费预算

开支科目 预算经费(元) 主要用途 阶段下达经费计划(元)
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 8200.00 11800.00
1. 业务费 16000.00 4700.00 11300.00
(1)计算、分析、测试费 3500.00 购买辅助工具 2000.00 1500.00
(2)能源动力费 0.00 0.00 0.00
(3)会议、差旅费 3000.00 交通、住宿费 1000.00 2000.00
(4)文献检索费 3500.00 论文专利检索 1700.00 1800.00
(5)论文出版费 6000.00 投稿论文 0.00 6000.00
2. 仪器设备购置费 1500.00 购买仪器、设备 1500.00 0.00
3. 实验装置试制费 1000.00 测试实验装置 1000.00 0.00
4. 材料费 1500.00 提供实验材料补给 1000.00 500.00

项目附件

  • 立项书平台申报(2)_原文对照报告.pdf
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结束