“菌调植顺”-黄瓜枯萎病拮抗菌的筛选及应用

申报人:刘惠 申报日期:2024-06-21

基本情况

2024
“菌调植顺”-黄瓜枯萎病拮抗菌的筛选及应用 盲选
创新训练项目
农学
自然保护与环境生态类
学生来源于教师科研项目选题
二年期
本项目主要是针对黄瓜枯萎病进行防治的研究与应用。我们从抗病性较强的黄瓜根际土中筛选出3株对黄瓜专化型尖孢镰刀菌具有拮抗作用的菌株,且菌株均具有产IAA和铁载体能力。通过盆栽试验研究了3株拮抗菌的生物学特性及其对病原菌的抑制机制。本团队通过开发拮抗黄瓜枯萎病的生物菌肥,拟解决由于使用传统化学农药易导致的黄瓜枯萎病产生抗药性、环境污染和农产品安全以及化学肥料的过度使用造成的土壤肥力下降等行业痛点问题。
本人曾参加第十四届“挑战杯”大学生创业计划竞赛,并从大二开始一直参与指导教师课题组开展的相关试验工作。本人所学专业为园艺专业,在项目团队担任项目负责人一职,负责与老师交流沟通,统筹跟进项目推进,管理协调团队日常工作。
本人主要从事土壤微生物调控作物根系分布方面的研究,参与国家自然科学基金、973计划、国家大宗蔬菜产业体系等国家级项目3项,主持校级课题1项,发表论文8篇,获得专利1项。
本人负责该项目的指导、监督和资金投放工作,在本人的指导下,团队成员已完成实验室部分的内容,下一步将寻找技术合作伙伴共同研发和生产高效的生物菌肥。
国家级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
刘惠 园艺园林学院 园艺 2022 在项目团队担任项目负责人一职,负责与老师交流沟通,统筹跟进项目推进,管理协调团队日常工作。
张恩源 应用科技学院、继续教育学院 园艺(专升本) 2023 在项目团队负责协助老师工作,收集数据和材料,撰写报告和进行数据分析等工作。
张诗颖 应用科技学院、继续教育学院 园艺(专升本) 2023 在项目团队负责协助老师工作,收集数据和材料,对数据的收集进行整合分类等工作。
李黎曦 园艺园林学院 园艺 2022 在团队负责协助老师工作、产品的Logo及外包装设计、线上线下宣传等工作。
韩福鑫 应用科技学院、继续教育学院 园艺(专升本) 2023 在团队负责协助老师工作、产品的Logo及外包装设计、线上线下宣传等工作。

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
何兴佳 园艺园林学院

立项依据

黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国设施内主栽果菜之一,但由于长期不良的种植习惯,造成黄瓜连作障碍严重,生产过程中经常遭受各种病害的侵害(程国亭等,2023)。其中,黄瓜枯萎病具有传播速度快、防治难度大等特点,目前已经成为制约黄瓜行业发展的痛点问题,此外,黄瓜枯萎病的爆发不仅会导致黄瓜产量和品质下降,还会造成土壤污染和生态失衡。
当前,传统的黄瓜枯萎病防治措施已经很难满足现代农业对环境、健康和可持续发展的需要。所以,开发和使用生防菌来对黄瓜枯萎病进行防控,是未来植物病害防控的发展趋势。本研究通过平板对峙试验,从抗病性较强的黄瓜根际土壤中筛选出拮抗黄瓜专化型尖孢镰刀菌的菌株,通过盆栽验证和菌株生物学特性检测分析其耐盐碱、促生、抑病的效果,本研究为黄瓜枯萎病病害生防制剂的研发提供理论依据和实践指导。
本项目主要是针对黄瓜枯萎病进行防治的研究与应用。通过体外培养试验和平板对峙试验,我们成功从抗病性较强的黄瓜根际土中筛选出3株对黄瓜专化型尖孢镰刀菌具有拮抗作用的菌株,且菌株均具有产IAA和铁载体能力,通过形态观察和分子生物学鉴定,最终确定3株菌株属于贝莱斯芽孢杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌。通过盆栽试验研究了3株拮抗菌的生物学特性及其对病原菌的抑制机制。本团队通过开发拮抗黄瓜枯萎病的生物菌肥,拟解决由于使用传统化学农药易导致的黄瓜枯萎病产生抗药性、环境污染和农产品安全以及化学肥料的过度使用造成的土壤肥力下降等行业痛点问题。
3.1 土传病害产生的原因及防治现状
土传病原菌是指通过土壤传播并引起植物病害的病原微生物,包括真菌、细菌、病毒和线虫等。土传病原菌的产生和传播原因主要是由于不当的农艺措施、过渡的施肥用药等造成土壤环境恶化,为病原菌的繁殖提供了有利的生存场所。随着病原菌的快速进化,抗药性的增加,以及人们越来越需要一种可持续的、低投入的农业方式,探索一种新的土传病害的防治方法,已经成为了一种迫切需要解决的问题,而控制土传病害对我国农业“双减”具有十分重要的意义(Cerda et al., 2017; Chen et al., 2019)。土传病害具有较强的隐藏性、较高的传染性,其中,枯萎病是危害较严重的土传病害之一,一旦发生就会造成蔬菜作物损失严重,甚至绝收。当前,以化学药剂为主的土传病原微生物控制方法虽能在短时间内取得较好的效果,但长期效果不佳,而且还容易造成环境污染,造成土壤农药残留问题,严重影响食品安全(Raman et al., 2017)。
近年来,对根际微生物拮抗病原菌的研究越来越受到重视,特别是对土传病害的控制更是引起了众多学者的重视。研究表明,植物通过“呼救”的方式在根际招募有益微生物的富集,形成了一道天然的保护网,进而增强了对病原菌的的防御能力(Ambrosini et al., 2016)。在“双减”政策背景下,使用根际生防菌来增强宿主植物对病原菌的抵抗力,从而改进土传病害的管理,已经成为目前和未来农业的发展趋势(Kurabachew et al., 2013)。目前,大量研究发现植物根际生防菌株可用于防控黄瓜枯萎病病害,且效果显著(王智荣等, 2019; 李雪萍等, 2022; 潘潇涵等, 2020)。
3.2黄瓜枯萎病产生的原因及其危害
黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)引起的一种严重的土传病害。这种病害在温暖潮湿的条件下特别容易爆发,侵入黄瓜植株的根部并通过维管系统扩散,阻碍水分和养分的运输,导致叶片黄化、枯萎甚至整株死亡(徐彦刚等, 2018)。此外,单一种植和连作加剧了病原菌在土壤中的积累,缺乏合理的轮作和休耕制度,导致土壤中的病原菌数量逐年增加,病害发生的几率和严重程度随之上升。另外,长期使用化学农药不仅会导致环境污染和农药残留问题,还会使病原菌产生抗药性,降低防治效果。同时,化学农药对土壤和非目标生物的破坏作用,也使得土壤生态环境进一步恶化。由于病原菌可以在土壤中长期存活且具有较强的传播能力,因此防治难度较大。目前市场上仍缺乏有效的生物防治手段,传统的防治手段效果有限,难以从根本上解决问题。在中国,黄瓜种植主要集中在河北、山东、河南、辽宁等地,全国黄瓜种植面积超百万公顷,每年因黄瓜枯萎病导致的损失可达数十亿元。受黄瓜枯萎病影响较大的是中小型农户和一些大规模种植基地。中小型农户往往缺乏先进的病害防治技术和手段,而大规模种植基地尽管有一定的技术和资金投入,但由于种植面积大,病害防治仍面临巨大挑战(Zhang et al., 2008; 黄晓庆, 2018)。

图1 黄瓜枯萎病发病情况
3.3土传病害的防治方法
3.3.1化学防治
在土传病害病发初期,应用化学药剂一种行之有效的防控措施。其中,甲基硫菌灵、腐霉利、菌核净、咪鲜胺、扑海因、丙环唑等对菌核病都有较好的控制效果,也可以通过喷雾与之配合使用。为了防止病虫害产生抗药性,在实际生产过程中我们应交替使用农药。
土壤熏蒸是一种通过施用化学熏蒸剂(fumigants)来杀死土壤中的有害生物(如病菌、昆虫和杂草)的农业技术。这种方法广泛用于农田、温室和苗圃中,以确保种植环境的健康和高效。常见的熏蒸药剂包括甲基溴、氯化苦、氯化镁和氯化铵、代森铵等,使用方法是将药物以气体的方式完全散布于土壤中,从而达到杀菌的目的。在进行土壤熏蒸时,要实现广谱灭菌,必须配套使用各种不同的灭菌药剂。
化学药剂虽然能有效控制病虫害和杂草,但也存在一些明显的缺点。这些缺点包括对环境的影响、对人类健康的潜在危害,以及对生态系统的破坏等。鉴于这些缺点,越来越多的农民和研究人员正在探索更加可持续和环保的农业病虫害防治方法,如生物防治、物理防治和综合病虫害管理等,以减少对化学药剂的依赖。
3.3.2农业防治
农业防治能够有效控制和减少土传病害发生和传播。在日常生产过程中,我们要及时清理作物的老叶黄叶,在收获之后,要及时拉秧,并进对土壤进行深翻和晾晒。也可以在撒上生石灰或秸秆(碎稻草或小麦秸秆等)后,对土地进行充分的翻耕,并用覆膜和浇水的方式,将其覆盖起来,并将其闷在大棚内7~15d,让土壤温度保持在40℃以上,从而将残余在大棚室内的病菌给消灭掉。
轮作:通过轮作不同的作物,可以打破病原体的生命周期,减少病害的发生。对有严重土传病害的田块,在进行土壤消毒前,应适度休耕。
选择抗性品种:种植经过培育具有抗病性的作物品种,可以有效减少病害发生。此外,将抗病砧木与高产接穗嫁接,结合两者的优点。
传统的农业防治只能缓解病虫害的发生,并不能完全控制其爆发,需要结合生物防治、化学防治、物理防治和农业措施等多种方法,可以更有效地防治病虫害,确保农业生产的可持续性。
3.3.3生物防治
生物防治是一种利用自然敌人、寄生物、病原体等生物手段来控制有害生物(病虫害)的农业防治方法。这种方法具有环境友好、可持续性强等优点,是现代农业病虫害综合管理(IPM)中不可或缺的部分(王丽丽等, 2019)。
生物防治是通过不同生物种群之间的相互作用来抑制植物病害的发生。生物防治具有环境友好、安全性高、可持续性强、抗性风险低等特点。因此,应用微生物控制植物病害已成为当前研究的热点。前人研究发现,从黄瓜根际土壤中筛选出3株菌株对黄瓜枯萎病病原菌具有强烈的拮抗作用(闫敏等, 2013)。王英姿等(2008)发现,木霉菌对黄瓜枯萎病也有较好的抑制效果,在降低化学农药使用的同时还能提升黄瓜的品质和产量。因此,生物防治作为一种环保、高效的病虫害防治方法,在农业上具有广阔的应用前景。
3.4生防细菌防治植物病害研究现状
3.4.1生防细菌的概况及其对土传病害的防治作用
近年来,随着生物防治技术的发展,有益菌的分离筛选工作得到了越拉越多人的关注,从植物根际土壤分离的有益菌为生防植物病害提供了丰富的菌种资源。例如,Solanki等(2014)通过从番茄根际土中分离得到9株拮抗立枯丝核菌的菌株,田间验证试验显示出较好的生防效果。Shen等(2005)从洋葱根际土中筛选到1株广谱拮抗菌普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)A21-4,对多种蔬菜病原微生物具有较强拮抗活性。欧阳晓伦等(2022)从银杏外种皮中分离筛选获得对灰梨孢菌、禾谷镰刀菌、藤仓镰刀菌、新月弯孢菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌6种供试植物病原菌均具有抑制作用,抑制率在60%~69%之间。此外,从水稻根部筛选出1株产铁载体的放线菌,该菌株具有促进植物生长的功效(Rungin et al., 2012)。一些内生真菌通过分泌次级代谢物或在土壤中改造一些能被植物吸收和利用的养分,也能防治植物病害并促进植物的生长发育(Ma et al., 2011)。结合目前国内外研究进展,芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、木霉菌属(Trichoderma)等生防菌在植物病害防控中应用广泛(Chowdappa et al., 2013; Ramos-Solano et al., 2014; Walia et al., 2014)。
3.4.2生防细菌的作用机理
生防细菌是一类分布广、种类繁多的菌株,其作用机理均为抑制病原微生物对宿主的危害(Bloemberg et al., 2001; Hong et al., 2011)。关于生防细菌能够促进植物生长和控制植物病害的机理,得到了人们的普遍认同,它们包括了:营养生态位竞争、产生抑菌物质、诱导植物抗性等(EL-Tarabily et al., 2006; Haas et al., 2000)。
(1)营养生态位竞争
在根际环境微环境下,根际生防菌能够通过快速占领养分来降低病害对养分争夺能力,从而达到防治病害的目的。例如,荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)因其生长速度快和侵袭力强,可在根系区域快速增殖并率先占据生态位(Marschner et al., 2004)。王小慧等(2012)也发现,通过添加无致病力的轮枝镰刀菌菌株XA,发现其可以降低西瓜根际病原菌的侵染,并可在西瓜根部进行高效的定殖,进而抑制病害的产生。
(2)产生抑菌物质
生防菌能够产生多种抑菌物质,通过多种机制来抑制和杀灭病原菌,从而保护植物免受病害。例如,枯草芽孢杆菌产生枯草菌素、红霉素链霉菌产生红霉素、木霉菌产生木霉素等均能够抑制多种真菌和细菌。一些生防菌通过产生几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶等降解真菌细胞壁,破坏真菌细胞结构。此外,一些生防菌产生挥发性有机化合物,具有抑菌和促进植物生长的作用。例如,木霉菌和枯草芽孢杆菌产生的2,3-丁二醇(2,3-Butanediol)和乙酸甲酯(Methyl acetate)具有抗菌活性(Compaoré et al., 2013)。
(3)诱导植物抗病性
生防菌能够通过多种机制诱导植物产生抗病性,从而提高植物对病原菌的抵抗能力。例如,一些生防菌能够使植物系统获得抗性(Systemic Acquired Resistance, SAR),这是一种由局部感染引发的全植物范围的防御反应。枯草芽孢杆菌能够通过诱导水杨酸的积累来增强植物的SAR。此外,生防菌还能诱导系统抗性(Induced Systemic Resistance, ISR),这是另一种由生防菌诱导的植物防御反应,主要通过茉莉酸(JA)和乙烯(ET)信号通路实现。生防菌通过刺激植物产生茉莉酸和乙烯,启动相关的防御基因,提高植物的抗病性(邵天蔚, 2017)。例如,荧光假单胞菌能够诱导ISR,提高植物对多种病原菌的抵抗力。前人研究发现,将一株拮抗菌株SQY162接种到盆栽番茄中后的1d内,茉莉酸途径(JA)中的关键基因 p/>72的表达量在24小时内大幅增加,直到第五天,其表达量依然保持在较高的水平(房志颖, 2016)。生防菌除了上述拮抗机制外,生防菌可以增强植物的物理屏障,提高其抵抗病原菌侵染的能力。例如:生防菌可以促进植物根系和茎叶中木质素和角质层的积累,增强植物组织的硬度,阻止病原菌的侵入。此外,生防菌能够激活植物的信号转导途径,启动一系列防御反应。例如:活性氧(ROS)的积累:生防菌可以诱导植物产生活性氧,活性氧作为信号分子能够启动植物的防御基因,提高抗病性。
综上所述,本研究以黄瓜枯萎病为主要防治对象,从抗病性较强的黄瓜根际土壤中筛选出黄瓜专化型尖孢镰刀菌具有有拮抗作用的细菌,并对其进行鉴定和分类。同时分析了这些拮抗细菌在体外和盆栽条件下对病害发展及植株生长影响,并探讨了其可能存在的拮抗机制,为后续拮抗黄瓜枯萎病生物菌肥的制作提供理论基础。
参考文献
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创新点:
(1)本项目利用多种筛选方法(如平板对峙法、抑菌圈法等)筛选出对黄瓜枯萎病具有高效拮抗作用的菌株。通过16S rDNA测序、PCR等分子生物学技术对筛选出的拮抗菌株进行精确鉴定,确保其种属和拮抗特性。我们筛选出的3株菌株除了具有拮抗黄瓜专化型尖孢镰刀菌外,还具有优良的促生能力、较强的耐盐碱能力。
(2)本项目对毕业论文(设计)改革进行了初探,项目负责人的毕业论文是依托本项目进行的,项目负责人所在年级为园艺22级,现已完成毕业论文的选题和开题,该项目的研究内容的一部分为该负责人毕业论文的研究内容,该同学预计20225年6月份之前完成与毕业论文相关工作。
项目特色:本项目利用生防菌能够减少化学农药的使用量,降低环境污染和对人类健康的威胁。生防菌作为天然生物制剂,对生态系统和非靶标生物安全性高,有利于生态环境保护。3株生防菌还具有分泌生长素和产铁载体的能力,能够促进作物生长和提高作物产量。此外,本项目整合了微生物学、植物病理学、分子生物学、农业工程等多学科的研究力量,提高项目整体创新能力。

5.1技术路线

5.2拟解决的问题

黄瓜枯萎病是一种由真菌引起的严重病害,严重影响黄瓜的产量和品质。传统的化学农药防治方法存在环境污染和对非目标生物的毒害等问题,因此需要寻找一种更加环保且有效的防治手段。本试验通过筛选拮抗黄瓜专化型尖孢镰刀菌,拟解决黄瓜枯萎病问题,找到黄瓜枯萎病安全、有效的防治方法,探究筛选出的拮抗菌对黄瓜枯萎病病原菌的拮抗机制。了解拮抗菌抑制病原菌通的途径(如产生抗生素、竞争营养和空间、诱导植物抗病性等)。开发将筛选出的拮抗菌应用于实际生产中的方法,包括拮抗菌的制剂化、田间试验和应用技术。确保拮抗菌在田间环境中能够有效发挥其拮抗作用,提高黄瓜的抗病能力和产量。

5.3预期成果

(1)开发出一种安全、有效的黄瓜枯萎病生防菌肥;

(2)发表SCI论文或中文核心期刊论文1篇。

(1)研发阶段(第1年)
① 目标:完成初步的菌肥研发,并进行实验室测试。
② 具体措施:
2024.06-2024.09
菌株筛选:从黄瓜根际土中筛选出对黄瓜专化型尖孢镰刀菌具有拮抗作用的微生物菌株。
2024.10-2025.03
实验室培养:优化菌株的培养条件,确保其在实验室环境下能够高效生产。
实验室测试:在实验室条件下对拮抗菌的有效性进行初步测试,包括对黄瓜枯萎病的抑制效果和对黄瓜植株的生长影响。
(2)小规模试验与优化阶段(第2年)
① 目标:在温室和小规模田间条件下进行试验,优化菌肥配方和应用方法。
② 具体措施:
2025.04-2025.06
温室试验:在温室条件下进行小规模试验,进一步验证菌肥的有效性和安全性。
2025.07-2025.10
配方优化:根据试验结果,优化菌肥的配方,包括微生物菌株的组合和浓度,以及肥料的其他成分。
应用方法优化:测试不同的应用方法(如浇灌、喷洒、土壤混合等),以确定最有效的应用方式。
2025.11-2026.06
安全性评估:进行全面安全性评估,确保菌肥对环境和非目标生物无害。
法规审批:准备并提交相关文件,申请国家或地方农业部门的批准和认证。
市场推广准备:制定市场推广计划,包括包装设计、品牌命名和市场推广策略,并开始建立销售渠道。
通过以上步骤,确保在2年内能够完成拮抗黄瓜枯萎病生物菌肥的研发、试验和初步推广,实现有效防治黄瓜枯萎病、提高黄瓜产量和品质的目标。
(1)完成对拮抗黄瓜专化型尖孢镰刀菌菌株的筛选
我们从黄瓜根际壤中分离纯化出110株菌株,拮抗黄瓜尖孢镰刀菌的有15株。其中,菌株Z4、Z31、L5对黄瓜尖孢镰刀菌抑菌直径分别为4.3 cm、4.25 cm和3.98 cm,Z4、Z31、L5的抑菌率分别为55.13%、54.49%、51.07%,具有较好的研究价值(图2)。
图2 拮抗菌株对黄瓜专化型尖孢镰刀菌的抑制效果

(2)盆栽试验验证了菌株对黄瓜生长和枯萎病发病率的影响

接下来我们对菌株的促生效果进行了分析,结果表明,接种拮抗菌株Z31、L5、Z4处理的黄瓜全株干重和株高均显著高于对照(图3)(P<0.05)。

图3 拮抗菌株对黄瓜生长及生防效果的影响

抑病效果分析发现,拮抗菌株L5、Z31、Z4处理后,黄瓜的发病率与只接种黄瓜专化型尖孢镰刀菌的处理相比分别显著下降了52.78%,47.22%,38.39%(图4)(P<0.05)。


图4 拮抗菌株对黄瓜枯萎病发病率的影响

只接种黄瓜专化型尖孢镰刀菌的植株病情指数为42.22,接种Z4、Z31、L5拮抗菌株处理的病情指数分别为26.66、21.11、18.89。由此说明,在平板对峙试验中表现出一定抑菌效果的菌株,在黄瓜抗病试验中发挥出一定的对枯萎病的防治效果。其中,Z31、L5对黄瓜枯萎病的防效分别为50.0%、55.26%,而Z4的防效为36.85%(表1)。

表1 拮抗菌株对苗期黄瓜枯萎病的防治效果


(3)完成对3株菌株促生指标的测定

我们对这些菌株的产IAA和铁载体等促生指标进行了测定,结果表明,L5的IAA产量为19.87±0.22 mg·L-1,Z31的IAA产量为17.99±0.11 mg·L-1,菌株Z4的IAA产量为15.09±0.65 mg·L-1。此外,菌株Z4、Z31、L5均出现橙黄色的螯合圈,菌株L5的螯合圈直径最大,产铁载体能力最强。

(4)完成拮抗菌株不同pH下生长曲线的测定

Z4在pH为5.0~10.0时都可以生长,对pH的要求不严格,Z31在pH为5.0~9.0时生长曲线趋近于一致,可以适应的 pH 条件较广。L5在pH为5.0~8.0生长曲线趋近于一致(图5)。

综上,3株拮抗菌能耐受的pH的范围较广,对生存环境的要求不严苛,能够适应较强的盐碱环境,具有较好的研发和利用价值。

图5 拮抗菌株在不同pH下的生长曲线

(1)已具备的条件
  申请者所在学校的生物技术中心和杂粮中心拥有荧光定量 PCR 仪、超速冷冻离心机、酶标仪、电转化仪、激光共聚焦扫描显微镜、荧光倒置显微镜、智能人工气候室、灭菌锅、超净台、发酵罐等仪器和设备。在实验室平台建设的基础上,申请者的课题组拥有 PCR 仪、灭菌锅、超净台、超速冷冻离心机等。此外,学校的实验厂站建设成果显著,基地有日光温室1栋,冷棚6栋;与大庆市共建大庆设施农业研究院,基地有日光温室4栋、冷棚7栋,均可供有偿使用。实验室条件可保证本研究工作的顺利完成。
(2)尚缺少的条件及解决方法
  生物菌肥项目的研发和推广需要大量的资金投入,包括实验室设备、研发人员薪资、原材料采购、生产线建设等。此外,市场推广和渠道建设也需要持续的资金支持。如果资金链断裂或资金不足,将直接影响项目的正常运行和推广进度。
(3)解决方法
  设立多元化的融资渠道,包括银行贷款、风险投资、政府补助、科研基金等。同时,合理规划资金使用,严格控制成本,确保资金的高效利用。由指导教师和项目负责人定期进行财务审计,及时发现并解决财务问题,确保资金链的稳定。

经费预算

开支科目 预算经费(元) 主要用途 阶段下达经费计划(元)
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 20000.00 17000.00 3000.00
1. 业务费 8000.00 5000.00 3000.00
(1)计算、分析、测试费 5000.00 5000.00 0.00
(2)能源动力费 0.00 0.00 0.00
(3)会议、差旅费 0.00 0.00 0.00
(4)文献检索费 0.00 0.00 0.00
(5)论文出版费 3000.00 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 5000.00 5000.00 0.00
3. 实验装置试制费 2000.00 2000.00 0.00
4. 材料费 5000.00 5000.00 0.00

项目附件

  • 笔杆论文检测报告.zip
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